L'histoire est axée sur Desmond Miles qui revit les actions de son ancêtre à l'aide d'une mystérieuse machine nommée l'« Animus ». Son aïeul, Altaïr est un assassin d'élite agissant en Terre Sainte à l'époque de la troisième croisade. Tombé en disgrâce, Altaïr doit exécuter plusieurs missions pour regagner son rang dans sa communauté. Le joueur contrôle librement le héros dans trois villes, à la recherche de ses cibles.